免疫磁珠和琼脂糖珠进行免疫***沉淀的区别

免疫磁珠和琼脂糖珠进行免疫***沉淀的区别

(1)转染后24-48

h

可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min,

细胞裂解液于4°C,

最大转速离心30

min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western

blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl

protein

A

琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3

次,每次3,000

rpm离心3

min;

(4)将预处理过的10μl

protein

A

琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein

A琼脂糖珠耦联;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C

以3,000

rpm

速度离心3

min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS

上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE,

Western

blotting或质谱仪分析。

注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton

X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体***同使用。

(3)使用对照抗体: