干细胞生物学中免疫裂解的分离步骤

蛋白质是一种大分子物质，不同蛋白质的分子大小不同，所以可以用一些简单的方法将蛋白质从小分子物质中分离出来，蛋白质的混合物也可以分离出来。根据蛋白质分子大小的分离方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质的常用方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中。浸入透析液中进行分离。超滤是一种过程，其中水和其他小分子通过离心力或压力被迫穿过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上。这两种方法都可以将蛋白质大分子与主要由无机盐组成的小分子分离开来。常与盐析、盐析结合使用，盐析后可用于去除引入的无机盐。滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，使超滤速度变慢，截留物的分子量越来越小。因此，在使用超滤法时，应选择合适的滤膜或选择切向流过滤，以获得更好的效果。

离心法通常与其他方法结合使用来分离蛋白质。当蛋白质和杂质的溶解度不同时，可以通过离心分离。比如在米渣提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后，通过离心初步分离有用物质和分解的杂质[3]。在具有密度梯度的介质中离心蛋白质的方法称为密度梯度(区带离心)。常用的密度梯度包括蔗糖梯度、多糖梯度和其他合成材料的密度梯度。可以根据所需的密度和渗透压范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心已被用于纯化苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白。所得产品纯度高，但收率低。姜晨等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果，利用溴化钠密度梯度，获得了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤，也称为凝胶渗透色谱，是根据蛋白质分子大小的不同来分离蛋白质的最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是，当不同的蛋白质流过凝胶层析柱时，大于凝胶珠孔径的分子无法进入凝胶珠内部的网状结构，而是被排除在凝胶珠之外。相反，使用溶剂时，孔径小于凝胶珠的分子会流出色谱柱。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。在甘露糖蛋白的纯化过程中，通过凝胶过滤可以获得良好的结果。纯度鉴定证明该产品为单一均匀的糖蛋白，分子量约为32 kDa，多糖∶蛋白质(88∶12)，甘露糖为多糖[1]。

2.根据溶解度不同进行分离纯化。

影响蛋白质溶解性的外界条件有很多，如pH值、离子强度、介电常数、温度等。然而，在相同的条件下，不同的蛋白质由于分子结构不同而具有不同的溶解性。根据蛋白质分子结构的特点，可以选择性地控制蛋白质混合物中某一组分的溶解度，达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和调节pH值、蛋白质的盐溶解和盐析、有机物。

等电点沉淀和pH调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点，在等电点处溶解度最低。相反，有些蛋白质在一定的pH值下很容易溶解，所以可以通过调节溶液的pH值来分离纯化。蛋白质王红新等人[8]研究了茶蛋白的提取工艺，发现在pH值时，茶蛋白的提取效果最好，提取率达到36.8%，初始纯化率为91.0%。李殿宝[9]从葵花脱脂粕中提取蛋白时，调节蛋白溶液的pH值。目标蛋白质在等电点沉淀。等电点沉淀法也适用于葡萄籽中蛋白质的提取。李等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3.8。他们采用碱溶法提取葡萄籽蛋白，得到了最佳提取工艺:1×10-5mol·L-65438。在40℃搅拌40 min后，葡萄籽中蛋白质的提取率达到73.78%。此外，碱法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性均优于酶法[11]。酸法提取的鲢鱼蛋白无腥味，色泽洁白，蛋白得率高达90% [65438]。

蛋白质中的盐溶解和盐析是中性盐显著影响球状蛋白溶解度的现象，其中增加蛋白质溶解度的现象称为盐溶解，反之为盐析。需要指出的是，相同浓度的中性二价离子，如MgCl2和(NH4)2SO4对蛋白质溶解度的影响，要远大于一价离子中性盐，如NaCl和NH4Cl。在葡萄籽蛋白的提取过程中，不仅可以用碱溶法提取蛋白，还可以用盐溶法提取蛋白。最佳提取工艺为:10%NaCl溶液，按料液比1∶25，30℃搅拌30min，蛋白质提取率为57.25% [10]。盐析法是从血液中提取免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸钠絮凝法和硫酸铵盐析法，其中硫酸铵盐析法在生产中应用广泛。因为硫酸铵在水中呈酸性，所以用氨水调节pH值至中性。为了防止不同分子之间的沉淀，通常控制蛋白质样品的含量。