酵母双杂交的具体过程是什么(中文)
901，leu2—3，112，ura3-52，his3-200，gal4A，gal8O~X，
Lys2:: 1u s-gallt-his3，gu s-gai2t t-
ADE2，ura3:: h吐1u s.h吐1t t.1acz)，YM187酵母。
细菌(NATQ，um3-52，his3-200，ade2-101，trpl-901，
leu2-3，112，g △，met，O△,URA3::GAL1U^s-
gal1t^t^·阿·莱斯，东北！, 1).I～bkt 7-p53是一种编码小鼠p53的卵。
白色(a.a.72-390)和gal 4 DNA BD(a . a . 1-147)融合。
蛋白质阳性对照质粒。Pcarrr7。t是编码SV40的大t。
抗原(a.a.87-7o8)和gal 4 DNA . BD(a . a . 1-147)的融合。
融合蛋白的阳性对照质粒，上述菌株和质粒购自
克隆技术公司。JIVl109大肠杆菌菌株购自promega。
公司。
1.2试剂鲑鱼精子载体DNA，YPD酵母培养物
medium SD minimum medium-dosupply-Leu
Dosupply，a leu/a Trp dosupply，a leu/Trp/his。
做补充，Ade//His//L~aTrp 130补充等。
都是从克隆技术公司购买的。硫酸腺嘌呤(腺嘌呤半硫。
Fate)是从Gibco购买的。PEG 3250购自适马。DMSO购自。
阿姆雷斯科.硝酸纤维素膜购自Phamacia。X-Gal购买
自从BBI。QIAprep Miniprep试剂盒购自QIAGEN公司
其常规分子生物学试剂购自北京华美生物公司。
1.3 pGBKT7.ps3和t ~ alrr7.t质粒用2。
在mL LB液体培养基中扩增pGBKT7-p53和pGADT7-t
谷物。分别采用小规模碱裂解法7 (AIK法)和QtarREP。
通过Miniprep试剂盒(QIAGEN方法)提取质粒。紫外线成分
分光光度法测定0D260/280，计算质粒DNA含量。
1.4酵母双杂交* *转化实验按照酵母操作手册进行。
建议的转换方法，取上述两种方法的不同量。
质粒pGBKT7—053和pGADT7。T * *被转化为AH109。
在酵母菌株中，转化细胞按照1: 10，1: 100，1:
稀释10003不同浓度，然后在SD/上涂抹100
在Trp//Leu平板上，在克隆生长后计数生长克隆的数量。
(cfu).计算* * *转化效率:转化效率cfu//。tgdna = cfu。
×悬浮细胞体积()×稀释倍数/[铺板体积()×
这里的DNA量是指使用的DNA量。
质粒的量而不是所有质粒的总量)。
1.5酵母双杂交序列转化实验取上述不同量。
将两种方法提取的PGBKT7—053转化到AH109酵母中。
菌株AH109 [PGBKT7-
53]，选择新鲜AH109[pGBKT7-1直径2-3伊朗。
P53]酵母单克隆4-8，接种于1 ml SD//Trp缺陷。
在液体培养基中，涡旋振荡为65438±0米拉，完全打散了菌群。添加1
将IIll的菌液转移到5O IIll的sD液体缺乏培养基中。将
PGADT7-T转化为AH109[pGBKTT-53]，其他方法相同。
酵母操作手册，按照1: 10，1: 100，1:
用三种不同浓度稀释1000，然后在SD/I上涂抹100。
关于Trp/。leu平板，生长后计数克隆数。
(cfu).根据上面的公式计算转换效率。
1.6联合pGBKT~.p53和p53的酵母双杂交交配试验
将PGADTrT质粒分别转化酵母菌株AH109和酵母菌株AH109。
YM187，在相应的SD缺陷型培养基平板上生长。
克隆后，分别选择2-3 NL/N酵母单克隆* * *各一株。
放置在一个1 IIll分离器中，其中含有0.5ml ypda液体介质。
在心脏导管中，通过涡旋振动65438±0分钟来完全破坏菌群，并且在3℃和200rpm (20-24小时)下进行培养过夜。100交配文化正在传播
SD/Leu培养基平板，200个交配培养物分散在。
Sd/His//I ~ u/tw (tdo)中板。二倍体数目的检测
目:将交配产物按三种不同浓度浓缩:1: 10，1: 100和1: 1000。
稀释，然后取100铺在SD/Trp/。低浓缩铀板。戴昌
克隆后计数cfu。计算二倍体细胞数:cfu×悬液。
漂浮细胞体积(ta)×稀释倍数/平板体积(ta)。
1.7地窖分析实验a1
1.7 . 1.8-半乳糖苷酶AH109的定性分析和检测
[pgbkt7-053+pgadt7-T]的8-半乳糖苷酶活性，选择
酵母克隆(新鲜直径为2-3 mm)用双对角线交叉，平铺在地板上。
在相应培养基平板上的灭菌硝酸纤维素膜上，3ocI=
倒置培养24小时。将薄膜在液氮中冷冻几分钟。
不要放10 s，30 s，1雨，2雨，30cI= 10 mill，放在浸液里。
在z buffer/x . gal(100ml z buffer，0.27 ml f ≥ I巯基b。
酒精，1.67ml的20 mg/m ~ X-Ga1)滤纸上的溶液(zbufedx。
Gal溶液(最好是浸湿的滤纸)，放置在3OcI =
观察，15雨时记录一次，此后每1 h记录一次。
时间。观察不同条件下菌落的颜色变化，并在酵母下面划线
阳性结果是菌落颜色在8小时内变蓝。同时
液氮的无限冻结时间为65438±0min，处于不同的显色温度。
f在(25℃，30℃，37℃)时；-半乳糖苷酶活性。
1.7.28半乳糖苷酶定量分析AH109
[pgbkt7-053+pgadt7-T]的8-半乳糖苷酶活性与[pgbkt7-053]相同。
当时以AH109[pCL1]为阳性对照，AH 109 [PGBKT7-053]。
+pG~rr7-T]和AH109[pGBKT~+pGADT~-T]为空。
身体控制，AH109是阴性控制。AH109的稀释[pCL1]
倍数为3，其他稀释倍数为1。具体步骤参照酵母。
操作手册。β半乳糖苷酶的计算单位为1000×OD∞/ ∞/
(t×V×ODao)，其中t为反应时间，v = 0.1毫升×稀释。
释放多个。