急求:高中生物选修课《生物技术实务》知识整理(整理考点)，在山东用，谢谢。

一、实验原理

1.酵母的细胞呼吸

酵母的表达是:C6H12O6+O2→CO2+H2O+能量。

酵母通过无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，表达式为:C6H12O6→C2H5OH+CO2+能量。

2.酵母发酵的最佳环境

酵母在好氧和厌氧条件下都能生存:在好氧条件下，酵母大量增殖，但不具有发酵作用；缺氧的情况下，繁殖速度变慢，但此时可以进行发酵。使用酵母发酵时，最好在有氧环境下通入足够的无菌空气一段时间，然后隔绝氧气进行发酵。20℃左右最适合酵母繁殖，酒精发酵最适温度为18℃ ~ 25℃，pH为弱酸性。

3.醋酸杆菌好氧菌在没有糖源，有氧的条件下，能将乙醇(酒精)氧化成醋酸。表达式为C2 H5 oh→ch 3c ooh+H2O；；当氧和糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。

醋酸菌生长的最适温度为30℃ ~ 35℃

二、实验步骤

1.对发酵瓶、纱布、榨汁机、葡萄汁容器等实验用具进行清洗消毒。用温水冲洗几次，然后用75%的酒精擦拭，晾干备用。

2.取500 g葡萄，去掉枝干和烂籽。

3.用清水冲洗葡萄1 ~ 2次，去除污垢，注意不要反复冲洗。

4.用榨汁机榨出葡萄汁后，放入发酵瓶中或将葡萄打浆，用干净纱布过滤后放入发酵瓶中，盖上瓶盖。如果没有合适的发酵装置，可以用500 mL的塑料瓶代替，但注入的汁液量不能超过塑料瓶总体积的2/3。

5.把发酵瓶放在合适的温度下发酵。

6.因为在发酵旺盛期CO2的产量非常大，所以要及时排气，防止发酵瓶爆裂。如果使用简单的发酵装置，比如瓶子(最好是塑料瓶)，每天松开瓶盖2 ~ 4次排气。

7点以后。10 d，可以开始抽样检验。比如可以检查酒的味道，酒精的含量，对酵母进行镜检。

8.果酒制成后，可在发酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后将装置调到30 ~ 35℃进行发酵，并适时对发酵液进行通气。如果找不到醋酸菌或者醋曲，可以尝试自然接种，但是效果不是很好。如果没有打气筒，可以打开瓶盖，用纱布盖住瓶口，减少空气中灰尘等的污染。

三、注意事项

请分析该设备的进气口、出气口和排气口的功能。为什么通气口要通过一根又长又弯的软管连接到瓶体上？结合果酒和醋的生产原理，你觉得这个发酵装置应该怎么用？

空气入口和出口

排放孔

答:通气口连接打气筒，用于醋酸发酵时通气；排气口用于排出酒精发酵过程中的CO2排放口用于取样。排气口要通过长而弯曲的软管与瓶体相连，其目的是防止空气中的微生物污染。使用该装置酿酒时，应关闭通气口；做醋时，进气口要接气泵，输入氧气。

话题2:制作腐乳

一、实验原理

1.参与豆腐发酵的微生物有很多，如青霉菌、酵母菌、曲霉、毛霉等，其中毛霉起主要作用。

2.毛霉是一种丝状真菌，常见于土壤、水果、蔬菜和粮食中，已发育出白色菌丝。

3.毛酶等微生物产生的蛋白酶能把豆腐中的蛋白质分解成小肽和氨基酸；脂肪酶可以将脂肪分解成甘油和脂肪酸。

二、实验步骤

1.将豆腐切成3cm×3cm×1cm的块。所用豆腐的含水量在70%左右，如果水太多，腐乳就不容易成型。

2.将豆腐块平放在铺有干粽子叶的盘中，可以提供菌种，保温。每块豆腐的间距相等，周围留有一定的空隙。豆腐上盖着干净的棕叶。气候干燥时，用保鲜膜将平板包好，但不要封得太紧，以免湿度过大，不利于毛霉的生长。

3.将平板放置在15 ~ 18℃的温度下。毛霉逐渐生长，大约5 d后，豆腐表面布满直立的菌丝。

4.当毛霉生长旺盛，呈淡黄色时，去掉平板周围包裹的保鲜膜和铺在上面的粽子叶，使豆腐块的热量和水分迅速散失，散发霉味。这个过程一般持续36 h以上

5.待豆腐完全冷却后，将豆腐间相连的菌丝拔掉，整齐地排列在容器中腌制。

6.毛霉盖豆腐块与盐的质量分数比为5: 1。培养坯体时，靠近平板无直立菌丝的一侧均匀朝向玻璃瓶边缘，将坯体分层垂直放置在容器中。分层加盐，并随着层数的增高增加盐的量，在瓶口表面撒更厚的盐，防止杂菌从瓶口进入。腌制8天左右。

【注意】用盐腌制时，要注意盐的量。盐的浓度过低，抑制不了微生物的生长，可能导致豆腐变质；如果盐的浓度过高，会影响腐乳的口感。

7.将黄酒、米酒、糖与各种香料(如花椒、胡椒、八角、桂皮、姜、胡椒等)混合。)根据不同口味做卤汤。卤汤的酒精含量应控制在65438±02%左右。

【注意】酒精含量与腐乳后期发酵时间密切相关。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用越大，延长了腐乳的成熟时间。酒精含量过低，蛋白酶活性高，会加速蛋白质水解，杂菌繁殖快。豆腐易腐难块。

8.广口玻璃瓶清洗后，用高压锅100℃蒸汽灭菌30分钟。将咸豆腐装入瓶中，加入卤汤及辅料，用酒精灯加热消毒瓶口，用胶带封口。常温下，六个月就能成熟。

三、注意事项

1.发酵腐乳的主要生产工艺是前期发酵豆腐，后期发酵豆腐。发酵初期的主要变化是毛霉在豆腐上的生长(白色空白)。发酵温度为15 ~ 18℃，不适合细菌、酵母和曲霉的生长，适合毛霉的缓慢生长。毛霉生长5 d左右，将白色空白变为空白。前发酵的作用是:一是豆腐表面覆盖一层菌膜，形成腐乳的“体”；二是毛霉分泌以蛋白酶为主的酶，有利于豆腐中所含的蛋白质水解成各种氨基酸。后发酵主要是酶和微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制和添加各种辅料(红曲、面曲、发酵酒)，减缓蛋白酶作用，促进其他生化反应，产生腐乳的香气。

2.毛霉是低等丝状真菌，多核，无性繁殖。毛霉是食品加工业中的一种重要微生物，它能产生能分解大豆蛋白的蛋白酶，常用于制作腐乳和豆豉。

话题3讨论酵素洗衣粉的洗涤效果

一、实验原理

1.酵素洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉。目前常用的酶制剂有四种:蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中碱性蛋白酶和碱性脂肪酶应用最广，效果最明显。

2.碱性蛋白酶可以水解血渍、奶渍等所含的大分子蛋白质。转化为可溶性氨基酸或小分子肽，并使污渍从衣服上脱落。脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶还能分别将大分子脂肪、淀粉、纤维素水解成小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。

3.本课题主要探讨关于加酶洗衣粉的三个问题:一、普通洗衣粉和加酶洗衣粉在洗涤衣物污渍上有什么区别；二是加酶的洗衣粉在什么温度下效果最好，三是加不同种类酶的洗衣粉，其乳液效果有什么区别。

二、实验步骤

1探究酵素洗衣粉和普通洗衣粉洗涤效果的区别。

①在两个编号的烧杯中，分别注入500mL水。

②取两块大小相同的白棉布，用滴管在每块白棉布上滴上等量的墨水，分别放入烧杯中，用玻璃棒搅拌。

③将两个烧杯放入相同温度的温水中，保温5分钟。

(4)称取5克酶洗衣粉和5克普通洗衣粉，分别放入两个烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀。保温10分钟。

⑤观察并记录两个烧杯中的洗涤效果。

探索加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件

①在三个编号的烧杯中，分别注入500mL水。

(2)取三块同样大小的白棉布，用滴管在每块白棉布上滴一滴食用油、鸡血、牛奶，分别放入烧杯中，用玻璃棒搅拌。

③将三个烧杯放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中，保温5分钟。

(4)分3份称取5克加酶洗衣粉，分别放入3个烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀。保温10分钟。

⑤观察并记录三个烧杯中的洗涤效果。

3探讨不同种类的加酶洗衣粉的洗涤效果

污染物蛋白酶洗衣粉脂肪酶洗衣粉复合酶洗衣粉普通洗衣粉

油渍

汗渍

血迹

观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。

三、注意事项

1.变量分析和控制

影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉用量、衣服的材质和大小、浸泡时间、洗涤时间。在这些因素中，水温是我们要研究的对象，其他因素在实验中应该保持不变。实验选择什么样的水温，需要实验者根据当地一年的实际气温变化来确定水温。通常冬季、春季、秋季和夏季可以分别选择5℃、15℃、25℃和35℃的水温，因为这四种水温更符合实际情况，对现实有指导意义。

2.清洗方法和材料的选择。

有机洗和手洗两种洗涤方式哪个更科学？控制变量哪个好？再者，洗衣机可分为半自动和全自动。相比之下，全自动洗衣机更好，尽量使用同型号的小容量洗衣机，机械搅拌效果相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。用衣服做实验材料并不理想，因为作为实验材料的衣服要在大小、颜色、清洁度上完全一致，这并不容易做到；另外，人为的给衣服添加污垢，比如血渍、油渍，也是不能接受的。因此，选择布料作为实验材料是可行的。在控制实验中，可以控制布料的大小、颜色和污垢量相同；同时也方便比较洗涤效果。

3.水量、水质、洗衣粉用量。

水量与布的大小成正比。实验用的布不容易太大，水量也不容易太多，但布要充分浸泡在水中。水和洗衣粉的用量可以参考下表。实际剂量可以根据实验过程中表格中的数据进行换算。如果实验用手洗，如教材图4-4所示，可以用一个1 000 mL的烧杯做容器，用500 mL的水，洗衣粉的用量可以是1 g或1.5 g。

洗涤方式:机洗和手洗。

水量0.5升0.5升

洗衣粉的用量是0.5 g 1 g或者1.5g。

其他相关问题简述如下。实验中可以用滴管控制污物量，待污物干燥后再进行实验；布要在洗衣粉溶液中浸泡同样时间；通过搅拌玻璃棒或筷子来模拟洗涤过程；模拟搅拌的时间、频率、强度要基本一致。

主题4酵母细胞的固定化

一、实验原理

1.利用固定化酶技术，将这种酶固定在一个颗粒状的载体上，然后将这些酶颗粒放入一个反应柱中，柱的底部装有一个有许多小孔的筛板。酶颗粒不能通过筛板的小孔，但反应液可以自由进出。在生产过程中，葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使得葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化的葡萄糖异构酶接触，转化为果糖，并从反应柱的下端流出。反应柱可连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。

2.固定化酶和固定化细胞是通过物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合通过化学键和物理吸附的方式进行固定化，而细胞多采用包埋的方式进行固定化。这是因为细胞大，酶分子小；大的酶难以被吸附或结合，而小的酶容易从包埋材料中泄漏。

固定化酶的优点:酶可以与反应物接触，与产物分离，重复使用。

固定化细胞的优点:成本更低，操作更简单，可以催化一系列化学反应。

二、实验步骤

1。细胞激活

称取lg干酵母，放入50 mL的小烧杯中，加入10 mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀成糊状，静置约1h，使其活化。

注射活化:让休眠的微生物恢复正常的生活状态。

2。配制浓度为0.05mo1/L的氯化钙溶液

称取0.83克无水氯化钙。放入200mL烧杯中，加入150mL蒸馏水充分溶解，备用。

3。制备海藻酸钠溶液

称取0.7g海藻酸钠，置于50mL烧杯中。加入10 mL水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，调整海藻酸钠至糊状至完全溶解，用蒸馏水调整体积至10mL。注意:加热时，用小火，或间歇加热，重复数次，直至海藻酸钠溶解。

4。海藻酸钠溶液与酵母细胞混合。

将溶解的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化后的醉母细胞，充分搅拌使其混合均匀，然后转移至注射器中。

冷却到室温的目的是防止酵母被杀死。

5。固定化酵母细胞

将注射器中的溶液以恒定的速度缓慢滴入配制好的CaCl _ 2溶液中，观察液滴如何在CaCl _ 2溶液中形成凝胶珠。将这些凝胶珠浸泡在氯化钙溶液中约30分钟。

注入CaCl2 _ 2溶液的作用:使胶体凝聚。

6固定化酵母细胞发酵

a)用蒸馏水洗涤固定化酵母细胞(凝胶珠)2-3次。

b)将质量分数为10%的150mL葡萄糖溶液转移至200mL锥形瓶中，然后加入固定的葡萄糖溶液。

酵母细胞在25℃下发酵24小时。

三、注意事项

1.海藻酸钠溶液的配制:小火，间歇加热，定容，如果加热过快，海藻酸钠会被烧焦。

2.海藻酸钠溶液与酶母细胞混合:冷却后混合，注意混合均匀，不要进入气泡。

3.固定化酵母细胞的制备:高度适宜，匀速滴加。

4.新形成的凝胶珠应在CaCL2溶液中浸泡一段时间，使Ca2+和Na+充分交换，形成的凝胶珠稳定。测试凝胶珠是否形成，可采用以下方法:用镊子夹起一颗凝胶珠，放在实验台上，用手挤压。如果不容易破，没有液体流出，说明凝胶珠制作成功。也可以用手在实验台上用力敲打凝胶珠。如果凝胶珠容易反弹，也说明制备的凝胶珠是成功的。

5.凝胶珠的颜色和形状

如果凝胶珠颜色过浅过白，说明海藻酸钠浓度低，固定化酵母细胞数量少。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明海藻酸钠浓度过高，制作失败，需要重新尝试。

主题DNA的粗提取和鉴定

一、实验原理

提取生物大分子的基本思想是选择一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提，需要利用DNA与RNA、蛋白质、脂类之间的理化性质差异，提取DNA，去除其他成分。

1.DNA溶解度

DNA和其他成分如蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中具有不同的溶解度。利用这一特性，可以使DNA充分溶解，杂质沉淀，反之亦然，从而达到分离的目的。

另外，DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的一些蛋白质溶于酒精。利用这一原理，DNA可以进一步从蛋白质中分离出来。

2.公差为2。酶、高温和洗涤剂的DNA

蛋白酶可以水解蛋白质，但对DNA没有影响。大部分蛋白质经不起60-80oC的高温，80oC以上DNA会变性。去污剂可以瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。

3.3的标识。脱氧核糖核酸

在沸水浴条件下，DNA遇到二苯胺会被染成蓝色，所以二苯胺可以作为鉴别DNA的试剂。

二、实验设计

1.实验材料的选择

所有含有DNA的生物材料都可以考虑，但使用DNA含量相对较高的生物组织更容易成功。

2.破碎细胞，得到含有DNA的滤液。

破坏动物细胞很容易。以鸡血细胞为例，在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，用玻璃棒搅拌，过滤，收集滤液。如果实验材料是植物细胞，需要先用去污剂溶解细胞膜。比如从洋葱中提取DNA时，在切碎的洋葱中加入一定量的去污剂和盐，充分搅拌研磨，过滤后收集研磨液。

注意:

①为什么加入蒸馏水会使鸡血细胞破裂？

蒸馏水是一种对鸡血细胞低渗的液体。大量的水可以进入血细胞，导致它们破裂。再加上搅拌的机械作用，加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。

②添加洗洁精和盐的作用是什么？

去污剂是离子型去污剂，可以溶解细胞膜，有利于DNA的释放。盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

③如果研磨不充分，对实验结果有什么影响？

研磨不充分会导致细胞核内DNA释放不完全，提取的DNA量较少，影响实验结果，导致二苯胺鉴定时无丝状沉淀，无蓝色。

④这一步得到的滤液中可能含有哪些细胞成分？

可能含有核蛋白、多糖、RNA等杂质。

3.从滤液中除去杂质

第一种方案的原理是DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同；第二种方案的原理是蛋白酶分解蛋白质而不分解DNA；方案3的原理是蛋白质和DNA具有不同的变性温度。

注意:

①为什么反复溶解沉淀DNA可以去除杂质？

将DNA溶解在高盐浓度的溶液中，可以去除高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度沉淀DNA，可以去除溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解和沉淀DNA，可以除去与DNA具有不同溶解度的各种杂质。

(2)方案二和方案三有什么区别？

第二种方案是用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白分离；方案三利用了DNA和蛋白质耐高温的差异，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

4.DNA沉淀和鉴定

过滤处理后的溶液，加入与滤液等体积的冷却乙醇溶液，静置2 ~ 3分钟。溶液中会出现白色细丝，这就是粗提的DNA。用玻璃棒朝一个方向搅拌，把丝卷起来，用滤纸吸干上面的水。

取两个20ml试管，在每个试管中加入5ml浓度为2mol/L的NaCl溶液，将灯丝放入其中一个试管中，用玻璃棒搅拌使灯丝溶解。然后，在两个试管中各加入4毫升二苯胺试剂。混匀后，将试管放入沸水中加热5分钟。试管冷却后，比较两种试管溶液的颜色变化，看溶解了DNA的溶液是否变成蓝色。

三、实验步骤——以洋葱为实验材料。

1.称取30克葱花，放入研钵中，加入少量石英砂帮助研磨，倒入10mL 2mol/L氯化钠溶液，充分研磨。

洋葱中含有挥发性刺激物，能有效降低刺激性，使实验顺利进行。上课前，老师可以把洋葱放在冰箱里放一会儿，让它凉而不冻；或者将洋葱切成几大块，放入清水中浸泡一会儿，使其挥发性刺激物溶于水中，可减轻刺激性。然后把洋葱切碎备用。研磨的主要目的是破碎洋葱细胞，将DNA溶解在2mol/L的氯化钠溶液中。不需要把洋葱磨成粥糊，浪费时间，影响实验效果。研磨时不要使用搅拌机(榨汁机)。虽然使用搅拌器可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切割成非常细小的颗粒，不能通过过滤除去。酒精只能直接倒入滤液中，很多洋葱小颗粒会因为轻而漂浮，DNA就藏在其中，难以分辨。学生看不到白色纤维状粘稠体的DNA。

2.研磨后，将汁液过滤到带有漏斗和纱布的小烧杯中，获得滤液。

3.向滤液中加入20毫升95%的酒精溶液，并沿着烧杯壁慢慢倒入，不要摇晃或搅拌。

此时，烧杯中的液体分为上下两层，下层浑浊，上层清澈。很快，上层溶液中会出现白色纤维状黏液，可用玻璃棒轻轻卷起。这是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。在DNA沉淀的过程中，避免摇动和搅拌(不摇动，容易分层，所以我们很容易观察到上清液中的细丝；搅拌会把非常软的DNA打碎成小块，不容易取出)。如果DNA不容易用玻璃棒卷起来，可以用表面粗糙的牙签代替，DNA提取液会包裹在牙签周围。

4.鉴别:取1号和2号两个试管，分别加入2mL的2mol/L氯化钠溶液，在1号试管中加入一些白色纤维，摇匀使其溶解，然后在每个试管中加入2mL二苯胺试剂，在沸水浴中加热5min。

四、注意事项

1.以血液为实验材料时，每100ml血液中应加入3g柠檬酸钠，以防止血液凝固。

2.加入洗涤剂后，动作要轻柔和缓，否则容易产生大量泡沫，不利于后续操作。加入酒精并用玻璃棒搅拌时，动作要轻柔，以免DNA分子断裂，形成DNA分子絮状沉淀。

3.二苯胺试剂现在要用，不然会影响鉴定效果。

4.4溶解度之间的关系。DNA和NaCl溶液的浓度:

当NaCl溶液的浓度低于0.1.4 mol/L时，DNA的溶解度随浓度的增加而降低。当NaCl溶液的浓度高于0.1.4 mol/L时，DNA的溶解度随浓度的增加而增加。

5.用于鸡血细胞液体的容器，优选塑料容器。

鸡血细胞破碎后释放的DNA很容易被玻璃容器吸附。因为细胞中DNA的含量已经比较少了，如果用玻璃容器吸附一部分，提取的DNA就更少了。所以实验时最好使用塑料烧杯和试管，可以减少DNA在提取过程中的损失。

主题6血红蛋白的提取和分离

一、实验原理

蛋白质的物理和化学性质差异很大，如形状、大小、电荷性质和数量、溶解性、吸附性和亲和力等，从而可以提取和分离各种蛋白质。

1.凝胶色谱法(分配色谱法):

原理(1):分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的缝隙，距离短，流动快；分子量小的分子通过多孔凝胶颗粒，距离长，流动慢。

(2)凝胶材料:多孔和多糖化合物，如葡聚糖和琼脂糖。

(3)分离过程:

混合物上柱→洗脱→大分子快流小分子慢流→收集大分子→收集小分子。

*洗脱:从色谱柱上端连续注入缓冲液，促进蛋白质分子的差流。

(4)功能:蛋白质的分离、生物大分子分子量的测定、蛋白质的脱盐等。

2.缓冲溶液

原理(1):由弱酸和相应的强碱弱酸盐(如H2CO3-NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等)组成。).通过调节酸和盐的量，可以制备不同pH值的缓冲液。

(2)缓冲作用:抵抗外界酸碱对溶液pH值的干扰，保持pH值稳定。

3.凝胶电泳:

原理(1):不同蛋白质的带电性质、电量、形状、大小不同，电场中作用力的大小、方向、阻力不同，导致蛋白质在电场中的运动方向和速度不同。

(2)分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

(3)分离过程:在一定的pH值下，蛋白质基团带正电荷或负电荷；加入更多带负电荷的SDS形成“蛋白质-SDS复合物”，使得蛋白质迁移速率只取决于分子大小。

二、实验步骤

1.样品处理

①红细胞的洗涤

洗红细胞的目的是去除杂质。采集的血样应及时进行短时间低速离心，然后用橡胶吸管吸出上层透明黄色血浆。将下层暗红色红细胞液倒入烧杯中，然后加入5倍的生理盐水，缓慢搅拌65438±00min，然后低速离心一小段时间。洗涤重复三次，直到上清液中没有黄色，表明红细胞已经被洗干净。

②血红蛋白的释放

在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

注意:红细胞液加入蒸馏水后体积应与原血相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。

2.粗分离

①血红蛋白溶液的分离

搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为四层。第一层是无色透明的甲苯层，第二层是薄薄的白色固体，是脂溶性物质的沉积层，第三层是红色透明液体，是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀。用滤纸过滤试管中的液体，除去可溶性沉淀层，然后在分液漏斗中静置一段时间，分离出下层的红色透明液体。

②透析

将1mL血红蛋白溶液放入透析袋中，将透析袋放入含有300mL物质的20mmol/L磷酸盐缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量小的杂质，也可以用来代替样品的缓冲液。

净化

调整缓冲液液位:打开色谱柱下端的出口，使柱内凝胶表面的缓冲液缓慢下降至凝固。

↓胶面平整并关闭出口。

加入蛋白质样品:用移液管将透析后的样品绕管壁移动，加入到色谱柱顶部。添加样本后，

∣打开下端的出口，让样品渗入凝胶床。在样品完全渗入凝胶层后，

↓关闭出口。

调整缓冲液水平:加入20mmol/L磷酸盐缓冲液至适当高度。

↓

洗脱:连接缓冲洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

↓

收集和分装蛋白质:当红色蛋白质接近层析柱底部时，将其收集在试管中。

4.纯度鉴定-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(可选)

三、注意事项

1.电泳技术

电泳技术是利用待分离样品中各种分子带电性质的差异以及电场作用下分子本身的大小和形状，使带电分子具有不同的迁移速度，从而达到分离、鉴定或纯化样品的目的。

2.红细胞的洗涤

如果分层不明显，可能是洗涤次数少，血浆蛋白无法去除的原因。另外，如果离心速度过快，时间过长，白细胞和淋巴细胞会一起沉淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

3.如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功？

因为凝胶是半透明的介质，你可以在旁边放一个垂直于凝胶柱的日光灯，检查凝胶是否填充均匀。

此外，还可以加入高分子有色物质，观察色带的运动。如果色带均匀、窄而平，则凝胶色谱柱的性能好。如果色谱柱中有线条或气泡，请轻轻敲击色谱柱以消除气泡，如果无法消除，请重新安装色谱柱。

4.凝胶为什么要填得紧密均匀？

如果凝胶填充不紧密、不均匀，就会在色谱柱中形成无效间隙，使本应进入凝胶的样品分子穿过这些间隙，打乱洗脱液的流动顺序，影响分离效果。

5.沸水浴中用洗脱剂处理湿凝胶的目的。

既节省时间，又能去除凝胶中可能携带的微生物，排除凝胶中的空气。

6.75国集团

“G”代表凝胶的交联度、溶胀度和分离范围，75代表凝胶的产水值，即每克凝胶溶胀时吸收7.5g水。

7.填充后立即用洗脱液洗脱的目的是使凝胶填充紧密。

8.添加柠檬酸钠的目的是什么？为什么要低速短时离心？你为什么搅拌得很慢？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放血红蛋白。

9.与其他真核细胞相比，红细胞的特点以及这一特点对于分离蛋白质的意义。

哺乳动物和人类的成熟红细胞是双面凹圆饼，没有细胞核和细胞器。其中所含的血红蛋白是有色蛋白，在凝胶色谱分离时，通过观察颜色可以判断何时应该收集液体。这使得血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

10.如何检测血红蛋白的分离是否成功？

如果凝胶柱装填成功，分离操作正确，可以清楚地看到血红蛋白的红色条带均匀、窄而平，随洗脱液缓慢流出；如果红带扭曲、分散、变宽，说明分离效果不好，与凝胶色谱柱的填料有关。