酶标抗体的制备技术辣根过氧化物酶酶标抗体的制备技术
HRP的分子量小(40kDa)，标记物容易渗入细胞。底物为H2O2，以二氨基联苯胺(DAB)为氢供体的反应产物为不溶性棕色吩嗪衍生物，普通光学显微镜即可观察到。在pH 3.5 ~ 12范围内稳定，对热和有机溶剂有稳定作用，可耐受63℃加热15 min。用甲苯和石蜡包埋或用纯乙醇和10%甲醛溶液固定为冰块，均不影响活性。溶解性好，5gHRP可溶于100mL缓冲盐溶液，可溶于饱和度62%以下的硫酸铵溶液，因此常采用硫酸铵分级沉淀法进行分离纯化。氰化物、硫化物、氟化物和叠氮化物能抑制HRP的活性，因此应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防失活。
任何能在HRP和H2O2存在下被酶催化与H2O2反应生成有色产物的化合物(氢供体)都可以使用显色剂。氢供体的产物可分为不溶性和可溶性两种。前者为3，3 '二氨基联苯胺(DAB)，适用于免疫组织化学。反应后，氧化的中间体迅速聚合形成不溶的棕色吩嗪衍生物。这种聚合物还能还原和螯合四氧化物，形成具有电子密度的产物，适用于电子显微镜检查。此外还有饱和联苯胺溶液，氧化产物为黄褐色，多用于酶免疫扩散的深线显色。邻苯二胺(OPD)是后者最常用的。该产品呈橙色，易溶且敏感，其最大吸收值为490nm，肉眼即可识别。易被浓酸终止，颜色可保持数小时不变，是ELISA中最常用的一种。但对光敏感，使用时应避光，有致癌作用。
为了用辣根过氧化物酶标记抗体，需要借助交联剂将酶连接到抗体分子上。常用的交联剂有高碘酸钠和戊二醛(CHO-(CH2)3-CHO-(CH2) 3-CHO)。HRP分子中与酶活性无关的糖基被高碘酸钠氧化成醛基，然后与抗体蛋白的氨基形成席夫碱。为了防止酶蛋白的氨基和醛基自偶联，在标记前用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中剩余的α-和ε-氨基。酶和抗体结合反应后，加入硼氢化钠(NaHB4)还原成稳定的缀合物。
[标记步骤]
(1)将5 mg辣根过氧化物酶溶于0.5mL蒸馏水中，加入1% 2，4和0.1mL二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液，在室温(20℃)下轻微搅拌1h。
(2)加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻轻搅拌30min，溶液变为黄绿色。
(3)加入65438±0毫升0.65438±0.6摩尔/升的乙二醇，在室温(20℃)下轻轻搅拌65438±0小时，以终止氧化反应。
(4)加入5mg抗体(Ig)，置于透析袋中，放入pH9.6的1 000 ml碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g，蒸馏水加至1 000 ml)中，4℃透析过夜3次。
(5)从透析袋中取出液体(约3 mL ),在4℃下加入5 mg/ml nahb40.2 ml，放置2小时或过夜。
(6)加入50%饱和硫酸铵(NH4)2SO4溶液(硫酸铵850g，蒸馏水至1 000 mL，用30%氨水调节pH至7.2)6mL沉淀结合物，然后在4℃放置30 min，以3 000r/min离心30min，取深层溶液(SPA不需要此步骤)。
(7)将沉淀溶于PBS(0.02M pH7.4)中，放入透析袋中，用此缓冲液透析6-12h，换液3次。
(8)向偶联物中加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加入等量的60%甘油，测定工作效价，然后少量分装(或冻干，不加甘油)低温保存备用。戊二醛是一种常用的同双功能交联剂，其两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白偶联物。反应可在温度范围为4-40℃、pH为6.0-8.0的缓冲溶液中进行，分为一步法和两步法。戊二醛一步法是将酶和待标记的抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二醛两步法是酶与戊二醛反应形成酶-戊二醛结合物，通过透析或层析除去，然后与抗体结合。
[标记步骤]
(1)将10mgHRP溶于0.2毫升1.25%戊二醛(用0.01mol/L和pH6.8PB稀释25%戊二醛至1.25%)，室温(约20℃)反应合并65433。
(2)用0.1.5 mol/l NaCl的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，去除游离戊二醛，或用0.01mol/L PBS透析，4℃过夜。
(3)将5mg抗体IgG溶于1mL 0.1.5mol/L NaCl中，然后与醛类HRP溶液(10mg/mL)混合。
(4)加入pH 9.6的0.1ml1mol/L碳酸盐缓冲液(调节pH至9.0 ~ 9.6)，在4℃电磁搅拌下合并24h。
(5)加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水中)并在4℃放置2h以封闭残留的醛基并终止反应。
(6)放入透析袋中，用0.01mol/L PBS和pH7.2 PBS在4℃透析过夜或过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集1峰的洗脱液，加入等量的60%甘油，测定工作效价，然后在4℃或-20℃少量分装。