高速逆流色谱仪的相关原理

高速逆流色谱是一种基于单向流体力学平衡体系的逆流色谱分离方法，是在研究旋转管流体力学平衡时偶然发现的。当螺旋管低速旋转时，螺旋管中的两相从一端分布到另一端。当一相作为流动相从一端向另一端洗脱时，另一相在螺旋管中的保留值约为50%，但这种保留会随着流动相流速的增加而降低，从而降低分离效率。然而，当螺旋管的旋转速度加快时，两相的分布发生变化。当转速达到临界范围时，两相将沿螺旋管长度方向完全分离，其中一段占据头端的一段，称为头端相，另一段占据尾端的一段，称为尾端相。高速逆流色谱利用了这种两相的单向分布。在螺旋管的高转速下，如果第一相从尾端进料，它将穿过尾端并移至首端。同样，如果从头端馈入，它将通过第一阶段，并移动到螺旋管的尾端。在分离过程中，首先将其中一种相(固定相)注入螺旋管，然后从合适的一端泵出流动相，这样它就可以携带样品在螺旋管中进行无限分布。仪器转速越快，保留的固定相越多，分离效果越好，分离速度大大提高，故称高速逆流色谱。

2.高速逆流色谱仪的基本配置

仪器的中心部分:(a) ITO多层线圈分离柱，由100-200m长，内径约1.6mm的聚四氟乙烯管沿适当内径的内轴缠绕十余层，管内总容积可达300mL左右。(b)平衡器，可以调节重量，其作用是相对于中心轴平衡两侧(a)和(b)的重量。当(a)和(b)在旋转控制器的控制下，在齿轮传动装置的作用下，绕中心轴线作顺时针或逆时针的行星运动时，即(a)- (b)都在旋转，但同时又在绕中心轴线公转，公转速度可以是0 ~ 4000转/分。线圈的两端通过中空的中心轴同时从线圈分离柱中抽出，一端用于抽取液体，另一端用于输出液体。仪器需要两种不相溶的液体，一种作为固定相，另一种作为流动相。仪器工作前，液体作为固定相的第一相被恒流泵压入线圈分离柱，然后被进样器注入待分离的样品，如图所示，最后流动相被恒流泵压入，同时中心部分开始运转，直到转速大于600r/min。此时，两相在线圈分离柱中具有相对运动的可能性。由于流动相的持续压力，阻止了固定相的流出，同时流动相携带样品在盘管分离柱中进行无限分配，使复杂样品得以分离。当流动相通过检测器时，由于不同的样品组分会产生不同的信号，所以可以用记录仪得到逆流色谱图，用馏分收集器逐级收集流动相可以得到复杂样品的分离组分。大型制备型HSCCC，柱体积可达530m1，最大进样量可达20g粗品；更小的分析型HSCCC柱体积为8m1，进样量为几十微克，最大转速可达4000r/min，分析能力与HPLC相当。

在常用的HSCCC基础上，提出了双模式高速逆流色谱(简称Dccc)，即以前一个流动相作为下一个固定相，洗脱方向相反。与传统的高速逆流色谱相比，直接逆流色谱无需预测溶质的保留时间和分配系数，可减少制备时间，消除洗柱时间，提高分离效率，降低溶剂选择的复杂性。但目前由于溶剂体系不完善，应用范围较窄。

三、高速逆流色谱的技术特点

1.适用范围广，适应性好。

由于溶剂体系的组成和配比可以无限大，理论上可以应用于任何极性范围的样品分离，在分离天然化合物方面有其独特性。由于聚四氟乙烯管中的固定相为液体，不需要固体载体，因此可以消除固液色谱中使用固体载体造成的吸附损失，特别适用于分离极性物质。

2.操作简单，容易掌握

仪器操作简单，对样品前处理要求低，可以制备、分离或分析一般的粗提物。

3.高回收率

不需要固体载体，消除了样品在固体载体上的不可逆吸附和降解造成的损失，理论上样品回收率可以达到。只要在实验中调整分离条件，一般都有较高的回收率。

4.良好的再现性

如果样品没有很强的表面活性和很弱的酸碱性，即使多次进样，其分离过程仍然保持很稳定，重现性相当好。

5.分离效率高，分离量大。

由于它不同于一般的色谱分离方法，可以实现梯度洗脱和反相洗脱，还可以进行重复进样，因此特别适用于制备分离，产品纯度高，制备量大。

6.分配系数

溶剂体系的选择是在色谱分离过程中同时选择两相，这是样品成功分离的关键，而样品中各组分的分配系数决定了这种溶剂体系是否合适，所以分配系数的测定是溶剂体系选择的重要环节。目前，分配系数的测定方法主要有薄层色谱法、毛细管电泳法、高速逆流色谱、生物活性分配比法和分析法。

7.溶剂体系和溶液体系待分离物质类型基本两相溶剂体系辅助溶剂非极性或弱极性物质正庚基(己烷)烷烃-氯甲烷正庚基(己烷)烷烃-甲醇(或乙酸乙酯)-氯甲烷中极性物质氯仿-甲醇、正丙醇、乙基异丙醇-正己烷、甲醇、极性物质正丁醇-甲醇、乙酸高速逆流。

上表根据被分离物质的极性列出了一些基本的溶剂体系供参考，包括非水体系和水体系。

溶剂系统的选择对分离高速逆流色谱至关重要。遗憾的是，到目前为止，溶剂体系的选择还没有充分的理论依据，而是建立在实践中积累的丰富经验的基础上。一般来说，溶剂体系应满足以下要求:溶剂体系不会引起样品的分解或变性，样品中各组分的分配系数一般认为在0.2-5的范围内，各组分的分配系数值应充分不同，分离因子大于等于1.5；溶剂系统不会干扰样品的检测；为保证固定相保留率不低于50%，溶剂体系分层时间不得超过30秒；上下两相的体积比合适，避免浪费溶剂；尽量使用挥发性溶剂，方便后续处理，尽量避免使用有毒溶剂。根据溶剂体系的极性，可分为弱极性、中等极性和强极性三类。经典的溶剂系统包括正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水。实验中要根据实际情况，总结、分析、参考相关专著和文献，从待分离物质的种类中寻找相似的分离实例，选择极性合适的溶剂体系，调整各种溶剂的相对比例，确定目标组分的分配系数，最终选择合适的溶剂体系。

第四，高速逆流色谱的应用

我国是世界上最早研究逆流色谱技术的国家，其应用范围非常广泛，如生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、生化、医药、农业、环境、材料、化工、海洋生物、无机离子、保健品原料、食品添加剂、化妆品等。

1.天然产物

HSCCC可采用不同理化特性和多种操作条件的溶剂体系，适应性强，为从复杂的天然产物中提取不同特性(如不同极性)的有效成分提供了有利条件。因此，在20世纪80年代后期，在世界范围内回归自然的浪潮下，高速逆流色谱被广泛应用于天然产物化学成分的分析、制备和分离，并且被报道的最多。

例如，用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(3∶7∶5∶5)分离粉防己干燥根的粗提物；红豆杉粗提物用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水(6: 3: 2: 5)或正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1: 1: I: I)分离。石油醚(40-60℃)/乙酸乙酯/甲醇/水(50: 70: 80: 65)体系适用于紫杉醇混合物的分离。用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(3: 7: 5: 5)可以有效地分离肉桂酸、阿魏酸和咖啡酸的混合物。紫杉醇和caphalornannine用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/乙醇/水(5: 7: 5: 1: 1.5)分离。氯仿/0.07摩尔/升磷酸钠0.04摩尔/升柠檬酸缓冲体系(pH:

5.08，1: 1)马钱子碱和士的宁的分离制备；用氯仿/甲醇/丙酮/水(5∶6∶1∶4)分离挪威云杉针叶的粗提物；杂交番茄枝籽粗提物用正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水(3: l0: IO: 7)分离，下相一般作为流动相。

此外，还有用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(7-epi-10-脱乙酰基紫杉醇1)等两步分离紫杉醇同系物的例子。第一步是(1: 1: 1: 660)。另外，采用多维高速逆流色谱(多维高速逆流色谱)连续分离制备异鼠李素和4，5，7-三羟基黄酮醇槲皮苷，采用氯仿、甲醇/水(4: 3: 2)体系J。总之，HSCCC对天然产物的分离制备非常适用，不仅适用于极性化合物，也适用于非极性化合物；它不仅可以用来去除天然产物粗提物中的杂质，还可以用来精制最终产品，甚至可以一步得到纯品。当分析型高速逆流色谱的仪器速度在2000转/分以上且溶剂系统合适时，分离速度可与高效液相色谱相当。

中药来源于天然植物或动物，HSCCC也可用于分离单味中药的有效成分或方剂的有效部位。例如何首乌的氯仿提取物。用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1: 1: 1)和氯仿/甲醇/水(4: 3: 2)分离得到大黄素和光敏色素，分离醇提物得到654。何首乌甲醇提取物用乙酸乙酯/甲醇/水(50: 1: 50)分离，下相作为流动相。用氯仿/甲醇/0.1 mol/L盐酸(4: 1.5: 2)分离制备黄连生物碱，下相为流动相。当归提取物用R134a/甲醇/水体系分离，流动相为RliM-a，固定相为甲醇/水(65: 30或70: 30)。用氯仿/甲醇/水(4: 3: 2)分离银杏叶提取物，得到4，5，7-三羟基黄酮醇、异鼠李素和槲皮苷纯品。总之，HSCCC在中药方剂的分离制备方面还是一个空白，开展该领域的HSCCC工作意义重大。

2.抗生素

由于粗品可直接送入高速逆流色谱，高速逆流色谱也用于抗生素的分析、制备和分离。样品体积为1 mg-5 g。

通常，疏水系统可用于分离抗生素。对于未知样品，强极性组分是含正丁醇的体系，中等疏水性组分是含氯仿的体系，疏水性组分是含正己烷的体系。例如，用氯仿/氯乙烯/正己烷/甲醇/水(1: 1: 35: 1)体系分离柔红霉素衍生物，上相作为流动相。以苯/氯仿、甲醇/水(15: 15: 23: 7)分离埃洛霉素(Na in)混合物，进样量为100mg，上相为流动相。用乙醚和甲醇/水(5: 1: 4: 5)分离放线菌素(肌动蛋白，静脉)～(2+)复合物。注射量达到83 mg，上相用作流动相。氯仿/甲醇/水(4: 4: 3)体系用于分离氯己定衍生物。注射量为100 mg，上相用作流动相。用四氯化碳/甲醇/0.01 mol/L磷酸钾缓冲液(pH = 7) (2: 3: 2)分离Niddamycins混合物。注射量为65438±000mg；；伊维菌素用正己烷/L乙酸乙酯、甲醇/水(19: 1: LO: LO)分离，进样量25 mg，下相为流动相。用氯仿/乙酸乙酯/甲醇/水(3: 1: 3: 2)分离普那霉素等。

3.蛋白质和肽

高速逆流色谱分离制备蛋白质或多肽混合物的最新进展主要取决于以下三个因素:(1)采用低粘度溶剂体系，其中大部分含有正丁醇；新型pH带萃取逆流色谱的出现和发展:高速逆流色谱和离子对逆流色谱的综合应用。后两种逆流色谱技术将在下面详细描述。如杆菌肽用氯仿/苯/甲醇/水(15: 15: 23: 7)分离，进样量可达100 mg，以上相为流动相；用氯仿/乙醇/水(5: 4: 3)或氯仿/乙醇/甲醇/水(5: 3: 3: 4)进行分离，注射量可达50mg。用正丁醇/0.03摩尔/升三氟乙酸(1: 1)分离粘杆菌素；使用正丁醇/二氯乙酸/0.1 mol/L甲酸铵(1: O.O1: 0.01)、叔丁基甲基醚/乙腈/三氟乙酸(0.5%-5%) (2: 2: 3)和叔丁基甲基醚/乙腈/三氟乙酸。用正丁醇/0.2摩尔/升甲酸铵(pH:8.5)(1:1.5℃)或正丁醇/0.2摩尔/升甲酸铵(pH = 9) (1: 1)分离胆囊收缩素。

4.食物

HSCCC在食品分离中最大的优势是可以直接进样粗或复杂的样品，一般用于食品解毒或生物活性物质的制备。比如通过HSCCC检测食物中毒素的含量，分离出SEA(一种引起食物污染的常见毒素)[28]；用正己烷/乙腈/叔丁基甲基醚(10: 10: 1)从芹菜中分离Falcarind和Falcarindiel[29]；糖和PNP衍生物用HSCCC正交螺旋管行星离心法分离，溶剂系统为正丁醇/乙酸/水(4∶1∶5)或正丁醇/甲醇/水(4∶1∶4)。在分离体系中，通过衍生化可以增加分子的疏水性，从而实现分离。

5.无机物

高速逆流色谱在分离无机物中的应用主要集中在稀土元素或重金属元素。如以混合的0.5mol/lα(磷酸二乙基己酯)和十二烷为固定相，盐酸为流动相，富集稀有元素；用盐酸和氯仿(溶于0.15 mol/L的Depha) (1: 1)分离镧系元素Sm、Gd、Tb、Dy、Er、Yb，效果良好。以EHPA(乙基己基磷酸酯)和单-2-乙基己基醚的甲苯溶液体系为固定相，含钬、铒等镧系元素的溶液(相当于流动相)从顶部洗脱，金属元素在固定相中富集。发现稀土元素络合物的保留值与流动相的pH值有很大关系。随着pH值的增加，保留体积增加，但理论塔板数减少。此外，在流动相中，根据上述方法，HSCCC可用于环境分析、检测或污染控制。虽然灵敏度较低，但固定相可以富集干扰金属离子。

6.其他人

随着技术的发展，高强混凝土的应用范围逐渐扩大。已经尝试用高速逆流色谱拆分外消旋化合物。例如，N-十二烷基-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺已成功用于氨基酸衍生物的分离。有人用高速逆流色谱分离紫胶染料。溶剂体系为叔丁基甲醚/正丁醇/乙醇/水(2∶2∶1∶5)，所得物质的纯度约为95%。马和伊藤发现，增加有机固定相中手性选择性试剂的含量，增加溶剂体系的疏水性，可以提高色谱峰的分辨率。

动词 （verb的缩写）高速逆流色谱的展望

近年来，溶剂体系的选择范围越来越广。有人建议利用超临界二氧化碳的高扩散性、低粘度、流体特性和环境友好性等无可比拟的优势，将其用作分离化合物的流动相，也有人建议使用制冷剂作为流动相。也有人提出，三相溶剂体系可用于高速逆流色谱分离，能很好地分离极性范围较宽的样品。目前，三相溶剂仅用于标准混合物的分离，而不用于特定天然产物的分离。相信进一步开发将在复杂天然产物和药物的分离中有很大的应用前景。

PH带逆流色谱是一种新发展的制备色谱技术，可以将样品的上样量提高10倍以上，即使是含量非常低的物质也可以得到高度浓缩。一对试剂-保留剂和洗脱剂被添加到固定相和流动相中。保留剂用于将样品中的组分保留在色谱柱中。当含有洗脱液的流动相以一定流速通过固定相时，由于酸碱反应最终达到平衡。用保留剂在两相中的浓度比来标定保留剂的分配系数，溶质的分配系数与标定值之差决定溶质的出峰时间，根据不同组分的Pka和疏水性的不同来实现分离。它的色谱峰以高度集中的矩形峰的形式一个接一个连接起来，重叠很少，很像交替色谱的色谱峰。

离子对逆流色谱是在固定相中加入适当的配体，提高溶质在固定相中的保留值，提高峰的分辨率。它已广泛应用于天然药物中多肽、生物碱和氨基酸的分离。

双模式逆流色谱(简称DuCCC)是指两相同时从螺旋管两端流入，从相应的端口流出，两相形成真正的逆向对流。与常规HSCCC相比，DuCCC具有更快的分离速度和更高的分离效率，且无需预测溶质的保留时间和分配系数，降低了溶剂选择的复杂性。这项技术可以应用于蛋白质分离。

HSCCC与质谱等其他技术的结合也是目前的研究热点，将HSCCC分离的多样性与质谱的高灵敏度检测和结构分析特性结合起来，具有非常广阔的前景。为了克服高速逆流色谱理论研究的相对落后，许多研究者从事理论研究，试图建立完善的理论基础来指导溶剂体系的选择，以使高速逆流色谱尽快从一门分离技术发展成为一门分离科学。

HSCCC是一种独特的无固体载体液-液分配色谱技术，是一种实用的分离制备技术，可以实现连续有效的分离。可以使用多种溶剂体系分离任意极性范围的样品，可以实现从微克、微升到数百毫克、克的制备和纯化的分析分离。适用于大量未经严格处理的粗样品的中间分离，也可配合质谱仪、红外光谱仪等分析仪器进行高纯度分析。具有非常广阔的应用前景。